Kırmızı Yoncadaki İzoflavonlar: Formononetin, Biokanin A ve Diğerleri

Kırmızı yonca hakkındaki neredeyse her yazı aynı cümlede duruyor: “izoflavon bakımından zengindir.” Doğru bir cümle ve neredeyse hiçbir işe yaramıyor. İzoflavon tek bir madde değil, bir bileşik ailesidir; elinizdeki Trifolium pratense partisinin bu ailenin hangi üyelerini — hangi formda, hangi oranda, hangi derişimde — taşıdığı ise formülasyona değecek bir ekstre ile hiçbir özelliği olmayan bir ekstre arasındaki farktır.

Bu yazı, pazarlama dilinin altındaki kimya. İzoflavonun ne olduğu, bu moleküllerin neden fitoöstrojen sayıldığı, kırmızı yoncada hangi dördünün baskın olduğu ve yapısal olarak birbirleriyle nasıl ilişkilendikleri, canlı bitkinin içinde hangi formda durdukları, gerçekte ne kadar bulundukları, bu miktarı neyin oynattığı ve tüm bunların nasıl ölçüldüğü. Özetin özetini değil birincil literatürü görmek isteyen formülatörler, eczacılar ve okurlar için yazıldı.

İzoflavon tam olarak nedir

İzoflavonlar, bitkiler âleminde rengin, acılığın ve kimyasal savunmanın büyük bölümünden sorumlu olan devasa bitkisel polifenol sınıfına, flavonoitlere aittir. Flavonoit iskeleti üç halkadan oluşur: oksijen içeren bir orta halka (C) ile birbirine bağlanmış iki aromatik halka (A ve B).

Bir izoflavonu sıradan bir flavondan ayıran şey, yalnızca B halkasının nereye bağlandığıdır. Flavonda C halkasının 2 numaralı konumundan sarkar; izoflavonda 3 numaralı konuma kaymıştır. Bu tek konum değişikliği bir ayrıntı değil — hikâyenin tamamıdır. Molekülü, artık tipik bir bitki pigmentine benzemeyen, bambaşka bir şeyi andırmaya başlayan bir biçime sokar.

İzoflavonlar bitkiler âlemine eşit dağılmış da değildir. Neredeyse tamamen Fabaceae — baklagiller — familyasında yoğunlaşırlar. Besinsel izoflavon tartışmasının her zaman soya, nohut, acı bakla, kaba yonca ve üçgül üzerinden yürümesinin, başka neredeyse hiçbir şey üzerinden yürümemesinin nedeni budur.

Neden fitoöstrojen sayılıyorlar

B halkasını 3 numaralı konuma taşıyın; izoflavonun iki uç hidroksil grubu arasındaki mesafe, 17β-östradiolün 3-hidroksili ile 17-hidroksili arasındaki mesafeye kabaca eşitlenir. Her iki molekül de büyük ölçüde düzlemsel ve benzer büyüklüktedir. Formül okumak yerine biçimi ve hidrojen bağı geometrisini tanıyan bir protein bağlanma cebi için izoflavon, vücudun başlıca östrojeninin kabul edilebilir bir taklididir.

“Kabul edilebilir” buradaki kilit kelime ve sayılar bunu sıfatlardan daha iyi anlatıyor. Booth ve arkadaşlarının klinik bir kırmızı yonca ekstresi üzerine yaptığı analizde, rekombinant insan östrojen reseptörlerine karşı yürütülen kompetitif bağlanma deneyleri genistein için ERα’da yaklaşık 0,30 μM, ERβ’de 0.020 μM IC₅₀ değeri verdi; daidzein için bu değerler sırasıyla yaklaşık 17 μM ve 1,2 μM oldu. Biokanin A yaklaşık 35 μM ve 4,1 μM’de kaldı. Formononetin hepsinin en zayıfıydı — ERα’da yaklaşık 104 μM, ERβ’de 60 μM — ve aynı ekibin yanı sıra yürüttüğü hücre temelli deneyde östrojenik etki göstermedi.

Bu tablodan iki sonuç çıkıyor ve ikisi de çoğu zaman gözden kaçıyor.

Birincisi, ERβ tercihi tutarlı ve çoğu zaman bir büyüklük mertebesi ya da daha fazla. İzoflavonların topyekûn östrojen ikamesi olarak değil, dokuya seçici bileşikler olarak tartışılmasının nedeni bu reseptör seçiciliğidir. Bu ayrımın neyi ima ettiğini, neyi etmediğini Fitoöstrojenler 101 başlıklı giriş yazımızda ele alıyoruz.

İkincisi — ve bu, özellikle kırmızı yonca açısından son derece önemli — bitkinin baskın iki izoflavonu, reseptöre doğrudan en zayıf bağlananlar arasında. Formononetin tek başına reseptörle neredeyse hiç etkileşmiyor. Araştırma literatüründeki yerini neredeyse tamamen, yutulduktan sonra başına gelenlere borçlu; o da kardeş yazımızın konusu: Kırmızı Yonca ve Soya İzoflavonları: Gerçekte Ne Farklı.

Kırmızı yoncanın baskın dördü — ve aralarındaki ilişki

Kırmızı yonca bir düzineden fazla izoflavon içerir, ama ezici çoğunluğu dört tanesi oluşturur: formononetin, biokanin A, daidzein ve genistein.

Bunlar birbirinden bağımsız dört molekül değil. İki çift:

• Formononetin, daidzeinin 4′-O-metil eteridir. Aynı iskelet; B halkasının 4′ konumundaki hidroksili kapatan bir metil grubuyla.
• Biokanin A, genisteinin 4′-O-metil eteridir. Aynı ilişki, ana bileşiklerde bir halka konumu farkıyla (genistein, daidzeinde bulunmayan fazladan bir 5-hidroksil taşır).

Metil gruplarını sökün, kırmızı yoncanın kimyası soyanınkinin üzerine oturur. Yerinde bırakın, elinizde farklı davranan farklı bir bitki olur. Kırmızı yoncada metillenmiş formlar açık ara baskındır: aşağıdaki Litvanya genotip taramasında çiçeklenme döneminde formononetin ve biokanin A birlikte toplam izoflavonun yaklaşık %91’ini oluşturmuş — sırasıyla kabaca %51 ve %40 — genistein ile daidzein ise küçük bileşenler olarak kalmış. Soyada profil tam tersidir; orada metillenmemiş genistein ve daidzein baskındır.

Bu ters çevrilmiş oran, kırmızı yonca fitokimyasına dair tek başına en önemli gerçektir ve soya bulgularının olduğu gibi aktarılamamasının nedenidir.

Bu dördünün ötesinde, Booth’un ekibinin analiz ettiği aynı klinik ekstrede ölçülebilir düzeyde irilon (preformülasyon ekstresinin yaklaşık %3,2’si), ayrıca her biri kabaca %0,4–1,1 aralığında pratensein, psödobaptigenin, prunetin ve kalikozin bulunmuş. Özellikle irilon, soyada karşılığı olmayan bir kırmızı yonca belirtecidir.

Glikozitler ve aglikonlar: ononin ve sissotrin

Canlı bir kırmızı yonca bitkisi izoflavonlarını yukarıda anlatılan serbest formda depolamaz. Glikozit olarak, yani şekere bağlanmış hâlde saklar; tipik olarak 7-O-glukozitler biçiminde ve sıklıkla şekere iliştirilmiş bir malonil esteriyle. Glikozillenme molekülleri suda daha çözünür, daha az reaktif ve vakuolde depolanmaya daha elverişli kılar.

Adıyla bilmeniz gereken ikisi:

• Ononin = formononetin 7-O-glukozit
• Sissotrin = biokanin A 7-O-glukozit

Şekere bağlı olmayan formlara aglikon denir. Bu ayrım kâğıt üzerinde bir sınıflandırma detayı değildir. Glikozitler ve aglikonlar çözünürlük, ekstraksiyon davranışı, kromatografik alıkonma ve emilim biçimi bakımından farklıdır. Üstelik herhangi bir numunedeki oranlarını yalnızca bitki belirlemez: hasat sonrasında olan biten bu oranı ağır biçimde etkiler. On üç çeşidi profilleyen Tsao ve arkadaşları, dondurarak kurutulmadan önce birkaç gün −5 °C’de bekletilen numunelerin analiz laboratuvarına ağırlıklı olarak aglikon içerir hâlde ulaştığını belirtiyor — hidrolizi, işlem sırasında bitkinin kendi enzimleri yapmış.

Pratik sonuç: “toplam izoflavon” bildiren iki analiz sertifikası, laboratuvarın numuneyi önce hidrolize edip aglikon eşdeğeri olarak mı raporladığına yoksa doğal glikozitleri olduğu gibi mi ölçtüğüne bağlı olarak, gerçekten farklı şeyleri ölçüyor olabilir.

Bitkide gerçekte ne kadar var

Çiçeklenme dönemindeki bütün bitki materyali için yayımlanmış en temiz rakamlar, kırmızı yonca genotiplerini çiçeklenme aşamasında profilleyen ve derişimleri kuru madde üzerinden bildiren Lemežienė ve arkadaşlarından geliyor.

Ortalamaya değil, aralığın genişliğine bakın. Toplam izoflavon içeriği, aynı denemede, aynı toprakta yetişen ve aynı aşamada hasat edilen genotipler arasında kabaca 1,5 kat değişiyor. Bu farkı tek başına genetik açıklıyor. Taranan genotiplerde formononetin ortalama 3,4 mg/g, biokanin A ise 2,7 mg/g civarında çıkmış; daidzein her ikisinden de bir büyüklük mertebesi düşük.

Oranların ne kadar dengesiz olduğuna da dikkat edin. Bitkide formononetin, daidzeinden kabaca otuz kat fazla. Kırmızı yoncayı kayda değer bir daidzein ve genistein kaynağıymış gibi ele alan biri, yanlış moleküller üzerinden düşünüyor demektir.

Bu miktarı ne oynatıyor

Dört değişken belirleyici.

Bitkinin hangi kısmı

İzoflavonlar bitkiye eşit dağılmaz. Tsao ve arkadaşlarının on üç çeşitlik taramasında en yüksek genel derişimi yapraklar taşımış; onu gövde, yaprak sapı ve çiçek izlemiş. Başka taramalarda çiçekler gövdenin üzerinde sıralanmış. Dürüst özet şu: yaprak dokusu tutarlı biçimde en zengin fraksiyondur, kalan toprak üstü kısımların sıralaması çalışmadan çalışmaya ve çeşitten çeşide değişir, en az katkıyı kök ve odunsu gövde verir. Etiketteki “toprak üstü kısımlar” ifadesinin göründüğünden az şey anlatmasının nedeni de bu.

Hasat zamanı

İzoflavon bileşimi, erken tomurcuk dönemi ile geç çiçeklenme arasında hem toplamda hem de tek tek bileşiklerin dengesinde ölçülebilir biçimde farklılaşır. Hasat tarihi bir tarım detayı değil, bir formülasyon kararıdır.

Çeşit ve genetik

Tabloya bakın. Aynı tarla, aynı gün, farklı genotip, 1,5 kata varan fark.

Kurutma, depolama ve işleme

Hasat sonrası işlemler, yukarıda anlatıldığı gibi glikozit–aglikon oranını belirler; sert kurutma ise bileşikleri doğrudan bozabilir. En çok değerin sessizce kaybedildiği aşama burasıdır ve en az açıklanan aşama da budur.

Hazırlama biçimi profili değiştirir

Ekstraksiyon tarafsız bir geri alma işlemi değildir. Seçer.

Malca-Garcia ve arkadaşları geleneksel kırmızı yonca preparatlarını doğrudan karşılaştırdı — sulu infüzyonlar, dekoksiyonlar ve %45 etanollü tentürler — kantitatif NMR, LC-MS/MS ve UHPLC-UV kullanarak, sekiz izoflavon aglikonu ile ononin ve sissotrini belirteç aldı. Üç hazırlama biçimi belirgin biçimde farklı kimyasal profiller verdi. Hem infüzyon hem de dekoksiyon, ononin ve sissotrin glukozitlerini %45 etanollü tentürlerden daha yüksek derişimde içeriyordu — su, çözünürlüğün öngördüğü gibi şekere bağlı formları tercihli olarak çekiyor.

Aynı çalışma daha beklenmedik bir şey de buldu. Tentür kimyasal olarak durağan değildi. Bir ay boyunca izlendiğinde biokanin A ve formononetin derişimleri kaydı ve altıncı gün civarında tepe yaptı — yazarlar bunu “dinamik artık karmaşıklık” diye tanımlıyor. Yani bir tentürün bileşimi, yaşına bağlı.

Hammadde şartnamesi yazan biri için: çözücü sistemi, çözücü oranı ve temas süresi süreç ayrıntısı değildir. Elinize hangi moleküllerin geçeceğini bunlar belirler.

İzoflavonların ötesi: klovamid ve gerisi

Literatüre izoflavonlar hâkim, ama bitkinin içindeki tek şey onlar değil; yaprak dokusunda tek başat fenolik bile değiller.

Klovamid — bir kafeik asit–DOPA konjugatı — Tava ve arkadaşları tarafından İtalya’da yetiştirilen kırmızı yoncanın yapraklarında 15,6 ± 0,6 mg/g kuru ağırlık düzeyinde ölçüldü; aynı yapraklarda 24,6 mg/g izoflavon ve 13,2 mg/g flavonol vardı, toplam fenolik içerik ise 53,7 mg/g idi. Bu, yaprağın fenolik yükünün kayda değer bir bölümü ve yalnızca izoflavon raporlayan hiçbir analiz sertifikasında görünmüyor.

Değişen düzeylerde şunlar da bulunur:

• Flavonoller — ağırlıklı olarak kersetin türevleri; glikozit ve malonillenmiş glikozit hâlinde.
• Kumestanlar — kumestrol ve medikagol dahil. Kumestrol ayrıca belirtmeye değer: Booth analizinde, ERα’da yaklaşık 0,06 μM ve ERβ’de 0,02 μM IC₅₀ değerleriyle, tanımlanan bileşikler içinde östrojen reseptörüne en güçlü bağlananıydı — ama ekstrenin ≤%0,01’i kadar bulunuyordu. Etki gücü ile bolluk ayrı eksenlerdir.
• Pterokarpanlar — maakiain ve glukoziti trifolirizin. Booth’un ekibinin profillediği klinik ekstrede pterokarpanlar materyalin %0,06’sını oluşturuyordu.
• Kumarinler — aynı ekstrede ≤%0,03 düzeyinde.
• Saponinler — triterpen glikozitleri; Kołodziejczyk-Czepas’ın cinse dair derlemesinde fenoliklerle birlikte ele alınıyor.

Fikir vermesi için: söz konusu faz II klinik ekstresinin tam dökümü %35,54 izoflavon, %1,11 flavonoit, %0,06 pterokarpan, ≤%0,03 kumarin ve ≤%0,03 tiramin şeklindeydi. İyi karakterize edilmiş, standardize bir ekstre bile kabaca üçte iki oranında kimsenin etikete yazmadığı materyalden oluşuyor.

Nasıl ölçülüyor

Yayımlanmış rakamların çoğu üç analitik yaklaşımdan geliyor.

HPLC-UV rutin miktar tayininde hâlâ ana yöntem. İzoflavonlar ultraviyolede kullanışlı biçimde absorplar, standartları ticari olarak bulunur ve cihaz her kalite kontrol laboratuvarında vardır. Lee ve arkadaşları, Trifolium pratense ekstresinde formononetin ve biokanin A miktarını belirlemek için özel olarak valide edilmiş, optimize bir HPLC-UV yöntemi yayımladı — şartname yazacak biri için makul bir başlangıç noktası.

LC-MS/MS, kütleye seçici dedeksiyon ekler; bileşikler birlikte elüe olduğunda, irilon veya kumestrol gibi küçük bileşenleri iri bir formononetin pikinin yanında ölçtüğünüzde ya da karmaşık bir matrikste çalıştığınızda ihtiyaç duyduğunuz şey budur.

Kantitatif NMR (qHNMR) sıra dışı olanı ve referans materyal için en kullanışlısı. NMR sinyali çekirdek sayısıyla doğrudan orantılı olduğundan, qNMR bir bileşiği o bileşiğe ait eşleşen bir referans standardı olmadan da ölçebilir — satın alınabilir standardı bulunmayan küçük bileşenler için değerli bir imkân. Malca-Garcia’nın ekibi kromatografinin yanında tam da bu nedenle kullandı.

Çalışmalar arası karşılaştırmaları başka hiçbir şeyin bozmadığı kadar bozan tek uyarı: numune analizden önce hidrolize edildiyse sonuç aglikon eşdeğeridir; edilmediyse sonuç doğal glikozitlerdir. Bunlar farklı büyüklükler. Hangisinin raporlandığını mutlaka kontrol edin.

Standardizasyon neden önemli

Yukarıdakilerin tamamı tek bir ticari gerçekte birleşiyor: kırmızı yonca ürünleri hatırı sayılır ölçüde değişkenlik gösteriyor ve etiket bunu çoğu zaman söylemiyor.

Wang ve arkadaşları piyasadaki bir dizi kırmızı yonca ürününü analiz etti; etiketlemenin muğlak olduğunu ve izoflavon içeriğinin ürünler arasında anlamlı biçimde değiştiğini bildirdiler. Ardından bu ekstreleri Caco-2 bağırsak hücre modelinden geçirdiler ve biokanin A ile formononetin için emilim hızlarının ve geçirgenliklerin de anlamlı biçimde farklılaştığını buldular — üstelik beklenmedik biçimde, sonucu yalnızca izoflavon derişimi değil, ürünün çevresindeki matriksin kendisi de etkiliyordu. Yazarlar vardıkları sonucu, alıcıların bilinçli seçim yapabilmesi için standardizasyona bilimsel destek olarak çerçeveledi. Ölçüyü kaçırmamakta fayda var: bu, bağırsak taşınımının hücre kültürü modeliydi, bir insan çalışması değildi ve klinik sonuç hakkında hiçbir şey söylemiyor.

Söylediği şey şu: “kırmızı yonca ekstresi içerir” bir şartname değildir. Şartname, belirteç bileşikleri, analiz yöntemini, bitkinin kullanılan kısmını, ekstraksiyon çözücüsünü ve kabul aralığını adıyla verir — ve rakamın aglikon eşdeğeri mi yoksa doğal glikozit mi olduğunu belirtir.

Mevzuat tarafında bir not: Trifolium Pratense Flower Extract gibi kırmızı yonca kayıtları AB’nin CosIng kozmetik bileşen veri tabanında yer alır. CosIng, kozmetikte kullanılan bileşenlerin atanmış işlevleriyle birlikte tutulduğu bir envanterdir — bir katalogdur, onay listesi değildir ve kayıtlı olmak etkililik hakkında bir beyan taşımaz.

Minerva108 kırmızı yonca ekstresini hazır bir ticari ekstre satın almak yerine kendi bünyesinde üretiyor; çünkü bir izoflavon profilinin korunduğu ya da kaybedildiği yer tam olarak ekstraksiyon ve hasat sonrası işlemlerdir. Bitki ve tedarik yaklaşımımız hakkında kırmızı yonca bileşen sayfamızda, cilt ve saç araştırmalarının gerçekte ne gösterdiği hakkında ise Kırmızı Yonca: Bilimin Sürekli Geri Döndüğü Anadolu Çiçeği yazımızda okuyabilirsiniz.

Sıkça sorulan sorular

Kırmızı yoncadaki başlıca izoflavonlar hangileri?

Dört tanesi baskın: formononetin, biokanin A, daidzein ve genistein. Formononetin ile biokanin A çok daha bol bulunur — çiçeklenme dönemindeki bir kırmızı yonca taramasında toplam izoflavonun sırasıyla kabaca %51 ve %40’ını oluşturmuş, genistein ile daidzein ise küçük bileşenler olarak kalmıştır. Kırmızı yonca ayrıca daha az miktarda irilon, pratensein, psödobaptigenin, prunetin ve kalikozin içerir.

Formononetin ile daidzein arasındaki fark nedir?

Tek bir metil grubu. Formononetin, daidzeinin 4′-O-metil eteridir — aynı molekül iskeleti, 4′ konumundaki hidroksilin üzerinde bir metil kapağıyla. Biokanin A da genisteinle aynı ilişki içindedir. Bağlanma deneylerinde metillenmiş formlar, östrojen reseptöründe metillenmemiş karşılıklarından belirgin biçimde daha zayıftır.

Ononin ve sissotrin nedir?

Bitkinin izoflavonlarını gerçekte depoladığı glukozit formlarıdır. Ononin, formononetin 7-O-glukozittir; sissotrin ise biokanin A 7-O-glukozittir. Sulu infüzyon ve dekoksiyonların bu glukozitleri %45 etanollü tentürlerden daha fazla içerdiği gösterilmiştir.

Kırmızı yonca ne kadar izoflavon içerir?

Çiçeklenme aşamasındaki bir genotip taramasında toplam izoflavon kuru maddenin 5,40–8,09 mg/g’ı aralığındaydı; formononetin 2,61–4,40 mg/g, biokanin A ise 1,79–3,32 mg/g düzeyindeydi. Bu rakam çeşide, bitkinin kullanılan kısmına, hasat zamanına ve hasat sonrası işlemlere göre oynar; dolayısıyla “kırmızı yonca” için tek bir sayı her zaman yaklaşık bir değerdir.

İki kırmızı yonca ekstresi neden farklı laboratuvar sonuçları veriyor?

Birden çok neden üst üste biniyor. Farklı çeşitler aynı büyüme aşamasında yaklaşık 1,5 kata varan fark gösterir; yaprak dokusu diğer kısımlardan zengindir; infüzyon, dekoksiyon ve etanollü tentürler farklı bileşikleri tercihli olarak çeker; sonuç ayrıca laboratuvarın numuneyi hidrolize edip aglikon eşdeğeri mi raporladığına yoksa doğal glikozitleri mi ölçtüğüne bağlıdır. Piyasadaki ürünlerin ölçülen izoflavon içeriğinde anlamlı farklılıklar gösterdiği de ortaya konmuştur.

Bu içerik bilgilendirme amaçlıdır, tıbbi tavsiye niteliği taşımaz. Kozmetik ürünler ve takviye edici gıdalar beşerî tıbbi ürün değildir; hastalıkların teşhisi, tedavisi veya önlenmesi amacıyla kullanılamaz. Hamileyseniz, emziriyorsanız, ilaç kullanıyorsanız veya bir sağlık durumunuz varsa kırmızı yonca takviyelerini kullanmadan önce bir sağlık uzmanına danışın.

Kaynaklar

1. Lemežienė N, Padarauskas A, Butkutė B, Cesevičienė J, Taujenis L, Norkevičienė E. The concentration of isoflavones in red clover (Trifolium pratense L.) at flowering stage. Zemdirbyste-Agriculture, 2015;102(4):443–448. doi.org/10.13080/z-a.2015.102.057
2. Booth NL, Overk CR, Yao P, ve ark. The chemical and biologic profile of a red clover (Trifolium pratense L.) phase II clinical extract. Journal of Alternative and Complementary Medicine, 2006;12(2):133–139. doi.org/10.1089/acm.2006.12.133
3. Malca-Garcia GR, Zagal D, Graham J, ve ark. Dynamics of the isoflavone metabolome of traditional preparations of Trifolium pratense L. Journal of Ethnopharmacology, 2019;238:111865. doi.org/10.1016/j.jep.2019.111865
4. Tsao R, Papadopoulos Y, Yang R, Young JC, McRae K. Isoflavone profiles of red clovers and their distribution in different parts harvested at different growing stages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006;54(16):5797–5805. doi.org/10.1021/jf0614589
5. Tava A, Pecio Ł, Stochmal A, Pecetti L. Clovamide and flavonoids from leaves of Trifolium pratense and T. pratense subsp. nivale grown in Italy. Natural Product Communications, 2015;10(6):933–936. pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26197520
6. Lee JH, Paje LA, Kim JY, ve ark. Validation of an optimized HPLC–UV method for the quantification of formononetin and biochanin A in Trifolium pratense extract. Applied Biological Chemistry, 2021;64:57. doi.org/10.1186/s13765-021-00630-5
7. Wang SW, Chen Y, Joseph T, Hu M. Variable isoflavone content of red clover products affects intestinal disposition of biochanin A, formononetin, genistein, and daidzein. Journal of Alternative and Complementary Medicine, 2008;14(3):287–297. doi.org/10.1089/acm.2007.0617
8. Pfitscher A, Reiter E, Jungbauer A. Receptor binding and transactivation activities of red clover isoflavones and their metabolites. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2008;112(1–3):87–94. doi.org/10.1016/j.jsbmb.2008.08.007
9. Kołodziejczyk-Czepas J. Trifolium species – the latest findings on chemical profile, ethnomedicinal use and pharmacological properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2016;68(7):845–861. doi.org/10.1111/jphp.12568